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RNA提取

Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍(Guanidine isothiocyanate)和苯酚(Phenol),其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到体系的溶液中。当加入氯仿时,它可萃取酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层(氯仿层),这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA就分离开了。水相层(无色)主要为RNA,氯仿层(黄色)主要为DNA和蛋白质。

RNA提取步骤(Trizol法)

                                    

                                                                                                

                                                                    RNA提取过程



在收集到生物材料之后,应即刻进行RNA提取工作。若需暂时储存,则应以液氮将生物材料急速冷冻后,储存于-80℃冷冻柜。在提取RNA时,将存贮于冷冻柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破细胞,不可以先行解冻,以避免RNase的作用。

1.    提取组织RNA时,每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解;提取细胞RNA时,先离心细胞,每5-     10x10个细胞加1ml Trizol后,反复用加样器吹打或剧烈震荡以裂解细胞;

2.    将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30℃下放置5分钟;

3.    在上述EP管中,按照每1ml Trizol0.2ml氯仿的量加入氯仿,盖上EP管盖子,在手中用力震荡15秒,在室温下(15~30℃)放置2~3分钟后,12000g2~8℃)离心15分钟;

4.     取上层水相置于新EP管中,按照每1ml Trizol0.5ml异丙醇的量加入异丙醇,在室温下(15~30℃)放置10分    钟,12000g2~8℃)离心10分钟;

5.     弃上清,按照每1ml Trizol1ml 75% 乙醇进行洗涤,涡旋器(Vortex)上混合,7500g2~8℃)离心5分钟,弃  上清;

6.     让沉淀的RNA在室温下自然干燥;

7.     用无RNA酶的纯水(Rnase-free water)溶解RNA沉淀;

        实验周期:根据样品量的多少而有所不同,一般约一周。




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