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猴外周血单核细胞

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分离PBMC步骤

PBMC简介

英文全称:Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC)

外周血单核细胞,指外周血中具有单核的细胞。

包含淋巴细胞(Lymphocyte)、单核细胞(Monocyte)、树突状细胞(Dendritic cell)和造血干细胞(Hematopoitic cell)等。

 

PBMC分离方法

原理

     外周血中各种血细胞的密度不尽相同,可用淋巴细胞分层液(Ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分层,从而使各种血细胞得以分离。



物品准备:外周血(或外周血来源的白细胞浓缩液)、生理盐水、50ml注射器×120ml注射器×310ml注射器×250ml离心管×715ml离心管×7、淋巴细胞分离液(Ficoll液)。

 

操作步骤如下:

1.       采集外周血并稀释之(外周血:稀释液PBS(或生理盐水)=11);

2.       向已有Ficoll液的离心管中,沿倾斜的管壁缓缓加入前项稀释了的外周血(Ficoll:稀释血=1:1);

3.       温和离心(20℃,800g30min);

4.       用移液器轻轻吸取PBMC层(即白膜层细胞)移入另一灭菌试管中;

5.       加入足够量稀释的PBS(也可用RPMI 1640)充分洗涤(轻轻振荡试管后),离心(700g离心10min),弃上清;

6.       以同上方法再来1-2次,时间缩短至5min,弃上清;

7.       根据所得细胞的量,加入适量(使细胞终浓度成为107)冻存液,分装入1.5ml EP管(0.5ml/管),-80℃保存。

 

★     如欲分离树突状细胞(DC)和淋巴细胞(Lymph),则

8.       用培养液(RPMI 1640)洗涤5-6次(离心速度800g-15min; 700g-15min; 600g-10min; 500g-10min两次),用含10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为2×106/ml,加入6孔板,于37℃,5% CO2孵育箱培养2h,吸去悬浮的细胞,用温热的(37℃)RPMI 1640培养基洗涤2遍,所得的贴壁细胞即DC前体细胞。

9.       所吸去的悬浮细胞(前面8项中)即为淋巴细胞,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(含猴IL-2)重悬,将细胞密度调整为1×106/ml,置于75cm2培养瓶内,37℃、5% CO2孵育箱中培养。隔天换含新鲜猴IL-2RPMI 1640培养基维持细胞活力,待用。

 

 

注意事项

1)       注意淋巴细胞分离液和细胞培养液在使用前都应水浴加温至室温;

2)       Ficoll液的加入应适量,外周血应充分稀释(至少血:PBS=1:1),稀释血和分离液的比例可以是1:12:1,最好达离心管的1/2-2/31/2最好,分层明显,即50ml的离心管只装到30ml

3)       离心机转速不宜过高(低于1000g),加速度也应缓慢上升,时间也不能过长(低速离心有助于去除细胞悬液中的血小板);

4)       环境温度直接影响到Ficoll液的比量,因此也影响分离效果(室温最好低于25℃);

5)       Ficoll液上加入稀释了的外周血时,应缓慢加入,以免充散各个液层的界面;

6)       吸取单核细胞层在白色时,应避免吸出过多的上清液或分层液而导致附近的血小板污染(可以先洗去血浆层,因内含血小板)。

7)       如分离后的细胞悬浮中有较多红细胞,可使用红细胞裂解液,37℃裂解5min,注意裂解时间不宜过长,以免影响单核细胞活性;

8)       离心后离心管中液体分为5层:血浆层、PBMC层、分离液层、粒细胞层、红细胞层(见下图)。



8.   低速离心有助于去除细胞悬液中的血小板,因此洗涤时离心速度较低。

 

PBMC产率


8.   低速离心有助于去除细胞悬液中的血小板,因此洗涤时离心速度较低。

 

PBMC产率

  每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞;




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