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实验猴抗体制备

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实验猴多抗的制备

 

一、实验步骤:

1.动物的选择:选择4-6岁雄性食蟹猴和狨猴各一只(SPF级)。

2.佐剂的制备:

佐剂:使用完全弗氏佐剂(Complete Freund Adjuvant),

组成:石腊油8.5 ml;羊毛脂1.5 ml;灭活结核杆菌10 mg。

3.抗原的制备:将供试物(XXXX)稀释为 ?mg/ml,然后与完全佐剂(CFA)混合制成抗原乳剂,用于免疫受试猴。

制备步骤:

(1)   油剂:石腊油和羊毛脂按比例混合,8磅高压灭菌20分钟备用。

(2)   水剂:灭活结核杆菌 ?mg/ml +抗原(供试物)? mg/ml (均为终浓度)。

(3)   供试抗原制备:油剂和水剂1:1混合,既得。

混合方式:于研钵中操作(充分研磨,油剂使用前水浴融化)。

4.免疫的方法:供试猴背部皮下多点(10点左右)注射,每点0.1~0.2ml(根据免疫应答情况适时调整)。

第1次免疫:两只供试猴注射加佐剂的抗原乳剂。

受   试   猴:在供试猴背部、腋下多点注射,共计2.0 ml。

第2次免疫:第一次免疫3周后,两只供试猴注射不加佐剂的抗原(供试物)。

受   试   猴:在供试猴背部、腋下多点注射,共计2.0 ml。

 第3次免疫:第二次免疫1周后,两只供试猴再次注射不加佐剂的抗原(供试物)。

 受   试   猴:在供试猴背部、腋下多点注射,共计2.0 ml。

 注:第3次免疫前,每只猴各取0.5ml静脉血检测抗体水平。

 第4次免疫:第三次免疫1周后,两只供试猴第3次注射不加佐剂的抗原。

 受   试   猴:在供试猴背部、腋下多点注射,共计2.0 ml。

 注:第3次免疫前,每只猴各取0.5ml静脉血检测抗体水平。

 

5抗血清的制备:

第4次免疫一周后,乙醚麻醉供试猴,心脏取全血(或无麻醉下隔断腕部血管取全血),室温放置(60min)凝固后,1500g离心(4℃,20min)分离血清。无菌条件下分装(0.5~1.0ml/管),-40℃以下冰箱保存。

6抗体效价(滴度)检测:双向免疫扩散法

      操作步骤:

      制备凝胶板:准备几个植化实验常用的跑板玻璃槽(或自己制作)。用生理盐水加热溶解琼脂配成1%溶                                                液,均匀浇注于玻璃槽内。注意不能有气泡,琼脂厚度约2.5mm。

       打孔:待琼脂凝固后,用去掉尖头的吸头(直径约为3~4mm)在凝胶上打孔,孔间距为3~5mm。在小孔中加                            入少量温热的液体琼脂,以防止渗漏(不可漏玻璃底儿)。孔的排列样式为梅花样,如下图所示:

                  

                加样:加样于孔内,左中间孔为抗原;右中间孔为无关抗原(牛血清白蛋白);边孔为不同浓度的抗体                                  (用生理盐水梯度稀释的系列抗体:1-1/4-1/16-1/64-1/256-1/1024-1/……)。注意不可外溢(加满为止)。                          结果观察:加样完毕,将琼脂槽平放于湿盒内,在室温或37℃扩散18-24小时后,观察结果,结果分析:

 

至此,所需时间大约为60天。

 

二.抗体纯化(以及单克隆抗体的制备):

1. 多抗的纯化

方法:无机盐析法-------硫酸铵(NH4SO3)沉淀法

步骤:

各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。

(1)配制饱和硫酸铵溶液(SAS)

将配好的SAS用氨水或硫酸调pH到7.0,既得饱和度为100%的硫酸铵溶液(4.1 mol/L,25°C);

(2)沉淀

①.   准确量取待纯化的抗血清体积(或重量)后,加入SAS [必须边搅拌边缓慢加入等体积的SAS,即终浓度为1:1(v/v)];

②.   将此混合溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4°C),使蛋白质充分沉淀。

(3)透析

①.   离心上述蛋白质溶液(4°C,20000g,30 min),弃上清保留沉淀;

②.   将沉淀溶于少量(10~20ml)PBS-0.2g/L叠氮钠中,待沉淀完全溶解后倒入透析袋进行透析(4°C,24~48hr),每隔3~6 hr更换透析缓冲液1次,以彻底除去硫酸氨;

③.   离心(2500g)透析液后,测定上清液中蛋白质含量。

说明:

(1). 杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,可用预沉淀法除去杂蛋白,具体做法是:

①.   边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中,使浓度为0.5:1 (v/v);

②.   将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时 或过夜(4°C);

③.   3、3000′g 离心30 min(4°C),保留上清液;

④.   上清液再加SAS到0.5:1 (v/v),再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS,同前透析,除去硫酸氨;

(2). 待处理的溶液体积过大时,可用固体硫酸氨进行盐析;

(3). 硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,纯化效果更好。

 

2. 单抗的制备(预案,待协商)

 

实验要求:

(1)操作步骤不能有差错,所有操作应有详尽、真实的记录存档;

(2)免疫时尽量选择淋巴较多的部位,以便供试猴及时产生抗体;

(3)从供试猴采血时,尽量无菌采集;

(4)工作进程中,依据实际情况可调整实验内容及步骤;

(5)其他

 


 





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